세포 배양이란 무엇입니까?
세포 배양
세포 배양은 자연 환경 외부의 통제된 조건에서 세포를 성장시키는 과정을 의미합니다. 그것은 세포 생물학 및 질병 메커니즘의 이해를 용이하게 하는 체외 도구입니다. 또한 약물 독성 시험 및 약동학/약력학 연구와 같은 약물 발견 및 맞춤형 의학에서도 역할을 합니다.
미국 배아학자인 Ross Granville Harrison은 20세기 초에 체외에서 개구리 배아의 조직 조각을 성공적으로 성장시키면서 최초의 체외 세포 배양 기술을 개발했습니다. 오늘날 세포 배양은 소아마비, 홍역, 볼거리 및 기타 전염병에 대한 백신 개발과 같은 수많은 발견을 도왔습니다.
접착 및 서스펜션 문화
세포 성장에는 부착 배양과 현탁 배양의 두 가지 기본 시스템이 있습니다. 부착 배양은 인공 기판에서 성장하는 반면 현탁 배양의 세포는 배지에서 자유롭게 떠 있습니다. 소수의 세포 유형(예: 림프구)만이 현탁액에서 자연적으로 성장하는 반면, 많은 부착성 세포 유형은 현탁액 배양에 적응될 수 있습니다.
현탁액에서 자연적으로 부착된 세포를 배양하는 데는 두 가지 이유가 있습니다. 현탁 배양의 첫 번째 장점은 세포를 배양 용기에서 효소적으로 또는 기계적으로 분리할 필요가 없기 때문에 세포가 더 쉽게 계대된다는 것입니다. 둘째, 현탁액 배양은 세포 성장이 이용 가능한 표면적이 아니라 배지 내 농도에 의해서만 제한되기 때문에 확장하기가 더 쉽습니다. 부유 배양의 주요 단점은 부착 배양이 현미경으로 쉽게 검사할 수 있는 반면 성장 패턴을 따르기 위해 매일 세포 수와 생존력 분석이 필요하다는 것입니다.
2D 및 3D 방법
부착 문화는 2D 및 3D 문화로 더 나눌 수 있습니다. 2D 응용 프로그램에서 접착 세포는 세포 배양 플라스크와 같은 평평한 표면의 단층 시스템에서 성장합니다.
세포 배양
단순성으로 인해 2D 기술은 일반적으로 복잡한 세포 간 상호 작용을 통해 3차원 구조로 성장하는 세포의 생체 내 환경을 모방할 수 없습니다. 이것이 스캐폴드 기반 또는 스캐폴드 없는 기술을 사용하여 성장할 수 있는 3D 문화를 사용하여 일부 실험이 수행되는 이유입니다.
스캐폴드 기반 3D 방법은 일반적으로 하이드로겔 스캐폴드에서 접착 세포를 성장시키는 것을 포함합니다. 바이오세라믹, 금속 또는 폴리머 스캐폴드와 같은 대안도 일부 응용 분야에 사용됩니다.
비계 없는 기술은 다음 세 가지 방법 중 하나로 회전 타원체를 성장시키는 데 사용됩니다.
강제 플로트: 세포 현탁액을 접착력이 낮은 폴리머 코팅 마이크로플레이트의 웰에 로드합니다. 그런 다음 마이크로플레이트를 원심분리하여 세포가 회전 타원체를 형성하도록 합니다.
행잉 드롭: 세포 현탁액을 행잉 드롭 플레이트의 웰에 로드합니다. 이름에서 알 수 있듯이 현탁액은 물방울로 플레이트에 매달려 있습니다. 세포는 이러한 물방울의 끝 부분에 모여 구체를 형성합니다.
교반 기반: 세포 현탁액을 회전하는 생물 반응기에 넣습니다. 지속적인 교반으로 인해 세포가 벽에 부착할 수 없어 회전 타원체를 형성했습니다.
세포 배양 도전
방법과 기술의 차이에도 불구하고 모든 실험에는 한 가지 공통점이 있습니다. 재현 가능한 결과를 얻기 위해 필요한 수의 살아있는 세포를 성장시키는 것이 어렵다는 것입니다. 따라서 다음 섹션에서는 반복성, 오염, 타당성 및 자동화로의 전환이라는 네 가지 문제에 대해 다룰 것입니다.
재현성
Yongyue Medical의 조사에 따르면 과학자의 70% 이상이 다른 과학자의 실험을 재현하지 못했고 절반 이상이 자신의 작업을 재현하지 못했다고 보고했습니다. 세포 배양 분석에서 대부분의 재현성 문제는 세포 계대 또는 세대 간의 생물학적 차이에서 발생합니다. 또 다른 큰 문제는 세포주의 오인이며 배양 매개변수의 불일치도 중요한 역할을 합니다.
생물학적 변이
무작위 돌연변이 또는 전사 오류와 같은 요인은 세포가 분열할 때마다 실험의 재현성에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이를 방지하려면 새 프로젝트를 시작할 때 세포 은행을 만들어야 합니다.
세포 은행
세포 뱅킹은 재현성에 영향을 미치는 무작위 돌연변이 또는 전사 오류와 같은 요인을 피하기 위해 나중에 사용하기 위해 특정 세포 유형의 배치를 저장하는 과정을 말합니다. 첫 번째 단계는 선택한 세포 유형을 배양하고 여러 용기에 동결 보존하여 마스터 세포 은행(MBC)을 구축하는 것입니다. MBC 배치는 해동되고 나중에 작업용 세포 은행(WBC)을 준비하는 데 사용됩니다.
세포주의 오인
세포주 오인의 문제는 과학자가 19개의 다른 인간 세포주의 HeLa 세포 오염을 기술한 1960년대부터 알려졌습니다. 결과를 신뢰할 수 있고 더 중요한 것은 잘못된 결론을 내리지 않으려면 기원이 확인될 때까지 실험실에 들어오는 모든 새로운 세포주를 격리해야 합니다. 가장 중요한 것은 동결 보존 및 다른 실험실에 배포하기 전과 프로젝트가 완료된 후에 세포주 적격성을 반복하는 것이 좋습니다. 세포주를 확인하려면 먼저 잘못 식별된 세포주 레지스트리에 나열되어 있는지 확인해야 합니다. 등록되지 않은 경우 진위 여부를 확인해야 합니다. 인간 세포주의 경우 STR(Short Tandem Repeat) 분석(DNA 지문 채취)이 권장됩니다. 핵형 분석, 동종효소 분석, 미토콘드리아 DNA 타이핑(DNA 바코딩)을 포함하여 비인간 세포주에 대해 다양한 테스트 방법을 사용할 수 있습니다.
배양 매개변수
재현성에 영향을 미치는 세 번째 요소는 배양 매개변수입니다.
예를 들어, 산소 수준은 배양 세포에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 챔버 크기 또는 세포 밀도와 같은 산소화에 영향을 미치는 변수는 항상 문서화되지 않으므로 일관성을 유지할 수 없습니다.
또 다른 중요한 배양 매개변수는 배지입니다. 이것은 필수 영양소, 성장 인자 및 호르몬을 제공하고 pH 및 삼투압을 조절합니다. 따라서 가장 중요한 것은 구성이 항상 동일하다는 것입니다. 이는 소태아혈청(FBS)이 보충된 중간 제형의 경우 특히 중요합니다. 그 구성은 젖소의 식단, 지리적 위치 및 계절과 같은 요인에 따라 달라집니다. FBS가 결과의 재현성에 미치는 영향을 최소화하려면 현재 재고가 부족해지기 시작할 때 혈청의 다른 배치를 주문하고 테스트하여 가장 일치하는 것을 찾아야 합니다. 다른 사람들이 당신의 결과를 재현하기 위해서는 혈청을 어떻게 스크리닝했는지 보고하고 로트 번호를 기록해야 합니다.
세포 배양
세포 처리
대부분의 연구자들은 배양 매개변수가 응용 프로그램에 큰 영향을 미친다는 것을 알고 있지만 처리 기술의 변화는 종종 간과됩니다.
오염
세포가 조직에서 분리되어 실험실에서 성장하면 더 이상 면역 체계에 의해 보호되지 않으므로 오염에 매우 취약합니다.
첫 번째 오염원은 내독소 및 침출물뿐만 아니라 배양 배지, 혈청, 보충제 또는 물의 불순물과 같은 비생물적 오염물질입니다. 예방 조치에는 세포 배양 실험을 위한 실험실 등급의 물과 내독소 테스트 인증을 제공하는 제조업체의 배지, 혈청, 보충제 및 소모품 사용이 포함됩니다. 또한 소모품은 플라스틱 첨가제가 세포 배양에 스며들지 않도록 순수 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌으로 만들어야 합니다.
두 번째 오염원은 박테리아(미코플라스마 포함), 진균 및 효모와 같은 생물학적 오염물질입니다.
실행할 수 있음
세포 생존율은 샘플에서 생존 가능한 세포의 비율로 정의됩니다. 방금 본 오염 물질 외에도 세포 생존력에 영향을 미치는 다양한 요인이 있습니다. 온도, pH, 삼투압, 영양소 가용성, O2 및 CO2 농도와 같은 환경 조건은 매우 중요합니다. 이러한 변수의 대부분은 매체에 의해 제어되며 세포 유형에 따라 다르므로 불행히도 특정 지침을 제공할 수 없습니다.
세포는 압력에 매우 민감하기 때문에 환경 조건뿐만 아니라 액체 취급 기술에도 주의를 기울여야 합니다.
세포 생존력에 영향을 미치는 마지막 요인은 노화입니다. 대부분의 유한 세포주는 죽기 전에 20~60번의 분열에서 살아남습니다. 즉, 15~45세대 사이에서만 재사용할 수 있습니다. 그 후, 동결 보존된 샘플을 세포 은행에서 해동해야 합니다. 연속 세포주는 무한정 증식할 수 있지만 유전적 부동 경향이 있기 때문에 정기적으로 교체해야 합니다.
비색법, 형광측정법 및 생물발광법을 사용하는 검출 분석법을 사용하여 세포 생존력을 측정할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 비색 방법은 살아있는 세포에 의해 노란색 테트라졸륨 염이 보라색 포르마잔 결정으로 환원되는 것을 기반으로 하는 MTT 방법입니다.
96-웰 플레이트
오토메이션
위에서 설명한 많은 문제는 세포 배양 작업 흐름을 자동화하여 해결할 수 있습니다. 예를 들어 세포 취급은 항상 일관되어 재현성과 생존 가능성에 긍정적인 영향을 미칩니다. 가장 중요한 것은 자동화가 사용자 오염의 위험을 줄여준다는 것입니다.
이러한 장점에도 불구하고 전체 워크플로를 자동화하는 것은 예산상의 이유, 로봇을 위한 공간 부족 또는 각 단계를 한 번에 자동화하고 검증할 리소스가 충분하지 않기 때문에 어려울 수 있습니다. 그러나 이것은 해결할 수 있습니다!