1. 회복
●1. 액체 질소에서 cryovial을 꺼내 즉시 37도 수조에 넣고 약간 흔 듭니다. 액체가 녹은 후(약 1-1.5분), 꺼내서 알코올을 약간 뿌리고 매우 깨끗한 작업대에 놓습니다.
●2. 상기 세포 현탁액을 10ml 배지가 채워진 15ml 원심분리기 튜브에 흡인하고(냉동보존 튜브를 배지로 세척하여 벽에 붙은 모든 세포를 씻어냄), 1000rpm에서 5분간 원심분리합니다.
●3. 상등액을 따라내고 배지 1ml를 첨가하여 세포를 현탁시킨다. 10ml의 배양액이 담긴 10cm 페트리 접시에 흡인하고 앞뒤로 부드럽게 흔들어 페트리 접시의 세포가 고르게 분포되도록 합니다.
●4. 세포 종류와 날짜, 배양기 이름 등을 표기하고 CO2 인큐베이터에 넣어 배양합니다. 세포가 벽에 부착된 후 배지를 변경합니다.
●5. 3일마다 매체를 변경합니다.
2. 통과
●1. 배양 접시의 세포 피복률이 80%-90%에 도달할 때 계대합니다.
●2. 원래 매체를 대기음.
●3. 적절한 트립신(세포를 덮을 만큼만)을 첨가하고 1-2분 동안 분해합니다.
●4. 세포를 둥글게 만든 후 동량의 혈청 함유 배지를 추가하여 소화를 종료합니다.
●5. 피펫을 사용하여 피펫으로 세포를 일시 중단합니다.
●6. 세포를 15ml 원심분리기 튜브에 넣고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리합니다.
●7. 상층액을 따라내고, 1-2ml 배지를 첨가하고, 세포를 부풀립니다.
●8. 세포 유형에 따라 여러 접시에 세포를 전송합니다. 일반적으로 5개의 암세포와 3개의 정상 세포가 있습니다. 계속 재배하십시오.
3. 동결보존 세포를 분해하고 원심분리합니다(ibid.). 준비된 동결 용액으로 세포를 현탁하고 멸균된 냉동 바이알에 분주하고 몇 분 동안 방치하고 세포 유형 및 냉동 보존 날짜를 표시합니다. 4도에서 30분, -20도에서 30분, -80도에서 밤새 보관한 후 액체 질소에 넣어 보관합니다. 동결 보존 용액의 준비: 70% 완전 배지 + 20% FBS + 10% DMSO. DMSO를 천천히 떨어뜨리면서 흔들어주면서 천천히 첨가해야 합니다.
