1. 세포 회복
동결보존된 세포를 액체 질소에서 제거한 후, 37도 수조에서 일정하게 흔들면서 해동하였다. 해동된 세포를 원심분리기 튜브에 옮기고 37도에서 예열된 DMEM 완전배지(태아혈청이 약 10%)를 넣고 부드럽게 불어 균일하게 불어 500g에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다.
DMEM 완전 배지를 추가하여 세척하고 상층액을 버립니다. DMEM 완전 배지를 첨가하고, 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고, 세포 현탁액을 만들고, 페트리 접시/플라스크에 접종하고, 5% CO2를 포함하는 세포 배양기에서 배양합니다.
2. 세포 통과
세포 밀도가 80%~90%에 도달하면(조기 수율이 부족하고, 너무 늦은 세포는 상태가 좋지 않으며, 1:2~1:10 이상의 비율로 계대배양, 일반적으로 1:3~1:5 세포 생성, 즉, 세포 접종부터 분리 및 재배양시 완전한 배지를 제거하고 1X PBS로 2회 세척하였다.
트립신을 추가합니다(참고: 소화액의 양은 세포를 덮는 것이 가장 좋으며 최적의 소화 온도는 37도입니다. 현미경으로 세포를 관찰하십시오: 거꾸로 현미경으로 소화된 세포를 관찰하십시오. 세포질이 수축되면 세포가 더 이상 서로 연결되어 있지 않습니다. 이때 세포가 적절하게 소화되었음을 나타내는 슬라이스), 소화하고 약 2-3분 동안 세포 인큐베이터에 넣습니다.
적정량의 DMEM 완전 배지를 추가하여 트립시니화를 중지하고, 원심분리기 튜브로 옮기고 500g에서 2분 동안 원심분리기를 사용하고, 상급체를 버리고, DMEM 완전 배지를 추가하여 세척하고, 상급체를 폐기합니다.
DMEM 완전 배지를 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 계수를 위해 10 마이크로리터를 피펫팅한 다음 필요한 세포 부피에 따라 5% CO2가 포함된 세포 배양기에서 계속 배양합니다.
3. 세포 동결 보존
세포 밀도가 80~90%에 도달하면 전체 배지를 제거하고 1X PBS로 2회 세척합니다. 소화를 위해 트립신을 추가하고 약 2-3분 동안 세포 인큐베이터에 넣습니다. DMEM 완전 배지를 추가하여 트립신 소화를 중지하고 원심분리기 튜브로 옮기고 500g에서 2분 동안 원심분리기를 넣고 상층액을 버리고 DMEM 완전 배지를 추가하여 세척하고 상층액을 폐기합니다. 동결액(90% fetal bovine serum, 10% DMSO) 1ml를 첨가한다. 일반적으로 혈청 함량은 10%~90% 사이에서 조절할 수 있다. 동결액에 혈청을 첨가하면 한편으로는 세포에 영양분을 공급할 수 있고 세포를 더 잘 보호하기 위해 수크로스, 알부민 등과 같은 세포 동결 보존 중 비투과성 보호 물질을 제공), 동결 보존 튜브에 넣고(온도 감소 속도를 보장하기 위해 튜브에 이소프로필 알코올이 있음), 즉시 넣습니다. 4도 냉장고에서 30분간 얼린 후 -20도 냉장고에 30분간 넣어두었다가 -80도 냉장고에 하룻밤 넣어두세요.
다음날 액체질소에 넣으면 2년 이상 보관이 가능하고, 액체질소에 넣지 않으면 3개월까지 보관이 가능하다.
세포 동결 보존 및 회수의 원리는 느린 동결 및 해동으로 세포 생존력 유지에 더 도움이 됩니다. 보호제 없이 세포를 동결보존하면 세포 내 얼음 결정이 생성되어 세포에 내인성 기계적 손상을 일으키고 세포 내 환경 삼투압, pH, 전해질 등의 변화를 일으켜 세포 사멸을 촉진합니다.
4. 주의사항
(1) 배양액 예열: 배양액, PBS, 트립신이 담긴 준비된 병을 37도 수조에 넣어 예열하는 단계;
(2) 75% 알코올을 사용하여 자외선이 조사된 울트라 클린 작업대와 손을 닦습니다.
(3) 사용한 도구의 올바른 배치: 작동하기 쉬울 뿐만 아니라 오염을 줄이는 충분한 작동 공간을 보장합니다.
(4) 알코올 램프에 불을 붙입니다. 불꽃이 너무 작아서는 안 됩니다.
(5) 엄격한 무균 작업;
(6) 부착 세포의 적당한 소화: 소화 시간은 소화액의 종류, 준비 시간, 배양 플라스크에 첨가된 양과 같은 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. 소화 과정에서 배양된 세포의 형태 변화에 주의를 기울여야 합니다. 세포질이 수축되면 연결이 느슨해지거나 조각난 징후가 나타나면 소화를 즉시 종료해야 합니다.
(7) 통과된 세포에 대한 모든 작업은 가능한 한 알코올 램프의 불꽃에 가깝게 해야 합니다. 각 셀에 한 세트의 장비를 사용하여 한 번에 하나의 셀에서만 작업하는 것이 가장 좋습니다. 교차 감염을 피하십시오.
(8) 계대된 세포의 병 입구는 열거나 닫을 때마다 알코올 램프로 멸균해야 합니다.
