막 졸업하고 입사하면 실시간 정량적 PCR 실험을 마주하는 수많은 명사들과 마주하게 됩니다. 어디서부터 시작해야 할지 혼란스러우신가요? 증폭 곡선, 표준 곡선, 임계값, CT 값, 용융 곡선 및 기준선의 의미는 무엇입니까? 그 실험에서 얻은 형광 이미지는 너무 밝았지만 식별할 수 없었습니다. 오늘은 기술 용어와 자주 묻는 질문의 두 부분으로 이러한 지식과 개념을 배우도록 안내합니다.
파트 I 전문 용어
1. 증폭 곡선
증폭 곡선은 사이클 수가 가로축이고 반응 동안의 실시간 형광 강도가 PCR 동안 세로축인 곡선을 말한다.
2. 기준선
기준선은 PCR 증폭 반응의 처음 몇 주기 동안 형광 신호의 변화가 거의 없음을 나타냅니다. 신호 레벨은 기준선인 직선에 가깝게 표시됩니다.
3. 형광 역치 설정
일반적으로 PCR 반응의 처음 15주기의 형광 신호를 형광 배경 신호로 사용하며, 형광 임계값은 PCR의 3-15주기 동안 형광 신호의 표준편차의 10배이며, 형광 임계값은 PCR 증폭의 지수 단계 동안 설정됩니다. 일반적으로 각 기기에는 사용 전에 형광 임계값이 있습니다.
4. CT 값
CT 값은 형광 신호가 설정된 임계값에 도달할 때 각 PCR 반응 튜브에 대해 발생하는 주기 수를 나타냅니다. 연구를 통해 우리는 각 템플릿의 CT 값과 해당 템플릿의 시작 사본 수의 로그 사이에 선형 관계가 있음을 알고 있습니다. 초기 사본 수가 높을수록 CT 값이 작아지고 그 반대도 마찬가지입니다. 알려진 시작 사본 번호가 있는 표준을 사용하여 가로 좌표가 시작 사본 번호의 로그를 나타내고 세로 좌표가 CT 값을 나타내는 교정 곡선을 만들 수 있습니다. 따라서 미지 시료의 CT 값만 구하면 표준 곡선에서 시료의 초기 사본 수를 계산할 수 있습니다.
더 알고
증폭 곡선이 좋은지 아닌지를 판단하는 몇 가지 지표가 있습니다.
대답: 곡선의 변곡점은 분명합니다. 특히 낮고 무거운 분획 샘플의 지수 위상이 분명하고 증폭 곡선의 전체 평행도가 매우 양호하며 기준선이 평평하고 상승 현상이 없으며 증폭 낮은 수준의 지수 위상 농도 샘플의 곡선은 매우 양호합니다. 분명한.
B: 곡선의 지수 위상의 기울기는 증폭 효율에 정비례하며, 기울기가 클수록 증폭 효율이 높습니다.
C: 표준 기준선이 평평하거나 약간 감소하고 뚜렷한 상승 추세가 없습니다.
D: 각 튜브에 대한 증폭 곡선의 평행도가 양호하여 각 반응 튜브의 증폭 효율이 유사함을 나타냅니다.
5. 녹는 곡선
PCR 산물을 가열하면 온도가 상승함에 따라 이중 가닥 증폭 산물이 점차 해리되어 형광 강도가 감소합니다. 특정 온도에 도달하면 많은 양의 제품이 분리되어 형광이 급격히 감소합니다. 이 기능을 다른 PCR 제품에 대한 다른 TM 값과 함께 사용하면 형광 신호가 급격히 감소하는 온도도 다르므로 PCR 특이성을 식별하는 좋은 방법이 될 수 있습니다.
6. 녹는 곡선(대수 곡선 사용)
융해곡선의 대수로 피크 그래프를 형성하여 제품 조각의 상황을 보다 직관적으로 표시합니다. 녹는 온도는 DNA 절편의 TM 값이므로 절편 크기, GC 함량 등과 같이 DNA 절편의 TM 값에 영향을 미치는 특정 매개변수를 결정할 수 있습니다. 증폭된 생성물의 길이는 80-300bp 범위에 있고 녹는 온도는 80도에서 90도 사이여야 합니다.
A: 80도에서 90도 사이에 주 피크가 하나만 있으면 Real-Time PCR이 완벽하다는 의미입니다.
B: 80도에서 90도 사이에 주요 피크가 나타나고 80도 미만에서 불순물 피크가 나타나면 기본적으로 프라이머-다이머로 간주됩니다. 이는 어닐링 온도를 높여서 해결하려고 시도하는 좋은 옵션입니다.
C: 80도에서 90도 사이에 주피크가 나타나고 온도가 올라갈수록 떠돌아다니는 피크가 나타나면 기본적으로 DNA 오염을 의심한다. 그리고 실험의 초기 단계에서 DNA를 제거해야 합니다.
7. 표준곡선
표준 표준은 다른 농도로 희석되었고 PCR 반응을 위한 주형으로 사용되었습니다. 표준 카피 수의 대수를 가로 좌표로 하고 측정된 CT 값을 세로 좌표로 하여 표준 곡선을 플롯합니다. 미지 시료를 정량화할 때 미지 시료의 CT 값을 기준으로 표준 곡선에서 시료의 복제수를 얻을 수 있습니다. 표준 곡선은 절대 정량화에 매우 중요합니다.
두 번째 부분. 일반적인 문제
Q1: RT-PCR, QPCR, 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR의 차이점은 무엇입니까?
A1: RT-PCR은 역전사 PCR로 널리 사용되는 중합효소연쇄반응의 변종입니다. RT-PCR은 RNA가닥을 상보적인 DNA로 역전사한 후 이를 PCR의 주형으로 사용하여 PCR에 의해 DNA를 증폭하는 것입니다.
Real-time PCR과 QPCR은 같은 것이며, 둘 다 Real-Time Quantitative PCR입니다. 즉, PCR 프로세스 동안 각 주기에서 데이터의 실시간 기록이 있음을 의미합니다. 이러한 방식으로 시작 템플릿의 수를 정확하게 분석할 수 있습니다.
실시간 PCR과 역전사 PCR 모두 RT-PCR로 약칭되는 것처럼 보이지만, 국제 관례에서는 RT-PCR이 구체적으로 역전사 PCR을 지칭하는 반면, 실시간 PCR은 종종 qPCR(Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - 시간 PCR).
실시간 RT-PCR(RT-QPCR)은 형광 정량 기술을 결합한 일종의 역전사 PCR입니다. 먼저 RNA에서 역전사하여 cDNA(RT)를 얻은 다음 실시간 PCR(QPCR)을 사용하여 정량 분석합니다.
Q2: 형광 정량 PCR에서 증폭된 product fragment의 길이를 80-300bp 범위 내에서 조절하는 이유는 무엇인가요?
A2: 각 유전자 서열의 길이는 다르며, 그 중 일부는 수 Kb 및 수백 BP입니다. 그러나 Primer를 설계할 때 산물의 길이는 80-300bp 정도만 요구하면 되며 너무 짧거나 너무 길면 정량적 PCR 검출에 적합하지 않습니다.
생성물 단편은 너무 짧아서 프라이머-다이머와 구별할 수 없습니다. primer-dimer의 길이는 30-40bp 정도이며, 80bp 미만일 경우 primer-dimer인지 product인지 구분하기 어렵습니다. 산물 조각이 너무 길어서 300bp를 초과하면 증폭 효율이 낮아지기 쉽고 유전자의 양을 효과적으로 검출할 수 없습니다.
예를 들어 교실에 있는 사람의 수를 셀 때 입이 몇 개인지 세기만 하면 됩니다. 유전자를 검사할 때도 마찬가지입니다. 전체 서열을 나타내는 유전자의 특정 서열만 검출하면 됩니다. 사람을 셀 때 입과 코, 귀, 안경을 모두 세고 있으면 실수하기 쉽습니다.
Q3: 프라이머 디자인을 위한 최적의 길이는 얼마입니까?
A3: 일반적으로 20-24bp 범위의 프라이머 길이가 좋습니다. 물론 Primer 설계 시 Primer의 TM 값은 최적 Annealing 온도와 관련이 있기 때문에 주의를 기울여야 합니다. 많은 실험 끝에 60도가 좋은 TM 값이라는 것이 입증되었습니다. 낮은 어닐링 온도는 쉽게 비특이적 증폭으로 이어질 수 있는 반면, 높은 어닐링 온도는 일반적으로 낮은 증폭 효율, 증폭 곡선의 늦은 피크 및 지연된 CT 값으로 이어집니다.
질문 4: 수집된 샘플의 양이 실험 결과에 영향을 줍니까?
A4: 아니요. 더 많은 샘플을 수집할수록 더 많은 RNA가 추출되고 더 많은 cDNA와 표적 단편이 있을 것입니다. 절대 정량화를 위해서는 대상 조각의 복제 수를 계산해야 하며 수집된 샘플의 양이 실험 결과에 확실히 영향을 미칩니다. 예를 들어, 혈액에서 C형 간염 바이러스 HBV 검출은 혈액의 일정량(1ml)에서 HBV 함량을 검출하는 것입니다.
과학 연구에서 일반적으로 사용되는 상대 정량화의 경우 샘플 수는 실험 결과와 관련이 없습니다. 상대 정량화는 대상 유전자와 참조 유전자 간의 비교를 의미하기 때문입니다. 동일한 핵산 가닥에 존재하는 업스트림 및 다운스트림 조각으로 간주하십시오. 표본 크기가 크면 기준 유전자와 표적 유전자가 동시에 같은 비율로 증가하므로 결과에 영향을 미치지 않습니다.
Q5: 역전사 효소의 효율이 실험 결과에 영향을 미칩니까?
A5: 위와 동일합니다. 우리는 더 높은 RT 효율을 원하지만 RT 효소가 상대적으로 안정적이고 균일한 결과를 얻는 것을 선호합니다. 이것은 주요 회사의 역전사 제품군의 최적화된 기능에 대한 테스트가 될 것입니다.
질문 6: TAQ 효소의 효율이 실험 결과에 영향을 미칩니까?
A6: TAQ 효소의 효율은 상대적으로 큽니다. 일반적으로 hot-start taq 효소가 필요하며 비교적 효율적입니다. 상용 형광 정량 키트의 경우 각 제조사에서 자체 제품에 따라 최적 상태의 효율을 100%에 가깝게 최적화하는데, 효율이 너무 낮으면 실험 결과를 얻을 수 없다. 다른 회사 제품의 경우 이는 품질의 척도입니다.
질문 7: 형광 염료의 양이 실험 결과에 영향을 줍니까?
A7: 예, 그럴 것입니다. 형광색소가 너무 포화되면 일부 기기에서 노이즈 간섭을 일으킬 수 있습니다. 형광색소가 포화되지 않고 형광 값이 너무 낮으면 조기에 안정기에 진입하고 증폭 곡선이 평평해집니다. 형광 정량 실험에서는 CT 값이 주로 보이므로 후기 증폭 곡선이 고원 단계에 진입하는 것은 중요하지 않지만 그림이 충분히 아름답지는 않습니다. 선택해야 하는 경우 채도가 약간 낮은 형광색소를 선택하여 시작하십시오. 그러나 같은 회사의 같은 제품을 사용할 경우 그 효과는 기본적으로 미미하다.
질문 8: PCR 튜브의 전송이 실험 결과에 영향을 미칩니까?
A8: 예. 그러나 동일한 제조업체의 동일한 소모품 배치의 경우 이 효과를 무시할 수 있습니다. 이는 좋은 선택이며 소모품의 광투과율 영향을 최소화하기 위해 고투과성 멤브레인이 있는 96-웰 플레이트를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
Q9: 작동 중 오류가 실험 결과에 영향을 미칩니까?
A9: 작업 프로세스의 영향은 주로 균일성에 반영됩니다. 균질성은 시스템의 모든 구성 요소가 균일하게 혼합되어 있음을 의미하며 순간 원심 분리로 이 문제를 해결할 수 있습니다. 또한 초보자의 경우 PCR 시스템을 20인치 이상으로 조정하는 것이 가장 좋으며 시스템이 너무 작을수록 오류가 발생하기 쉽습니다. 어닐링 온도가 올바르게 최적화되면 CT에 대한 프라이머 농도의 영향이 최소화됩니다. 그리고 어닐링 온도를 최적화하면 일부 작동 오류(예: 프라이머 농도)를 피할 수 있음을 알 수 있습니다.
요약하다
위는 초보자가 실험 중에 자주 접하는 몇 가지 질문과 질문입니다. 이러한 질문이 혼란을 해결하는 데 도움이되기를 바랍니다. 실험은 혼돈을 일으키고 문제를 해결하는 과정입니다. 실험을 통해 무언가를 얻을 수 있기를 바랍니다. 읽어주셔서 감사하고 다음에 또 뵙겠습니다!