세포 배양은 세포 및 분자 생물학에서 사용되는 가장 중요한 도구 중 하나이며 정상적인 생리학 및 생화학(예: 대사 연구, 노화), 약물 및 독성 화합물이 세포에 미치는 영향을 연구하기 위한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 세포 돌연변이 유발 및 발암. 또한 약물 스크리닝 및 개발, 생물학적 화합물(예: 백신, 치료용 단백질)의 대규모 생산에도 사용됩니다. 이러한 응용 분야에서 세포 배양을 사용하는 주요 이점은 클론 세포 배치를 사용하여 얻을 수 있는 결과의 일관성과 재현성입니다.
세포 배양
세포 배양은 동물이나 식물에서 세포를 제거하고 유리한 인공 환경에서 성장시키는 것을 말합니다. 세포는 조직에서 직접 제거할 수 있으며 배양 전에 효소적으로 또는 기계적으로 분리하거나 확립된 세포주 또는 균주에서 파생할 수 있습니다.
1. 기본 교육
1차 배양은 세포가 조직으로부터 분리된 후 적절한 조건 하에서 증식되어 모든 이용 가능한 기질을 점유할 때까지(즉, 합류에 도달할 때까지) 배양 단계를 의미합니다. 이 단계에서 세포는 지속적인 성장을 위한 더 많은 공간을 제공하기 위해 신선한 성장 배지가 있는 새 용기로 옮겨서 계대 배양(즉, 계대 배양)되어야 합니다.
2. 세포주
1차 계대배양 이후의 1차 배양은 세포주 또는 서브클론이라고 합니다. 1차 배양에서 파생된 세포주는 유한한 수명(즉, 유한함)을 가지며 계대될 때 가장 높은 성장 잠재력을 가진 세포가 우세하여 인구 성별에서 어느 정도의 유전형 및 표현형 균일성을 초래합니다.
3. 세포주
세포주의 하위 집단이 복제 또는 기타 방법에 의해 배양물에서 능동적으로 선택되는 경우 세포주는 세포주가 됩니다. 세포주는 종종 모계가 시작된 후 추가적인 유전적 변화를 얻습니다.
4. 제한된 세포주 및 연속 세포주
정상 세포는 일반적으로 증식 능력을 잃기 전에 제한된 횟수만 분열합니다. 노화라고 하는 유전적으로 결정된 사건입니다. 이 세포주는 유한이라고합니다. 그러나 일부 세포주는 형질전환이라는 과정을 통해 불멸이 되며, 이는 자발적으로 발생하거나 화학적 또는 바이러스에 의해 유도될 수 있습니다. 유한한 세포주는 변형을 거쳐 무한정 분열할 수 있는 능력을 획득할 때 연속적인 세포주가 됩니다.
지속적으로 배양된 세포주는 유전적 드리프트가 발생하기 쉽고 유한한 세포주는 노화에 처해 있으며 모든 세포 배양은 미생물 오염에 취약하며 가장 잘 운영되는 실험실에서도 장비 고장이 발생할 수 있습니다. 확립된 세포주는 교체에 많은 비용과 시간이 소요되는 귀중한 자원이므로 장기 보관을 위해 동결 보존하는 것이 필수적입니다.
소량의 남아있는 세포가 계대배양에서 얻어지면 종자 저장고로 동결하고 일반적인 실험실 사용으로부터 보호해야 합니다. 작업 재고는 냉동 종자 재고에서 준비하고 보충할 수 있습니다. 종자 스톡이 고갈되면 냉동 보존된 작업 스톡을 신선한 종자 스톡을 준비하기 위한 소스로 사용할 수 있어 초기 동결에서 양의 증가를 최소화할 수 있습니다.
배양된 세포를 동결 보존하는 가장 좋은 방법은 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 글리세롤과 같은 동결 보호제가 있는 완전 배지에서 액체 질소에 있는 것입니다. Cryoprotectants는 배지의 어는점을 낮추고 냉각 속도도 줄여 세포를 손상시키고 세포 사멸로 이어질 수 있는 얼음 결정 형성의 위험을 크게 줄입니다.
DMSO는 유기 분자가 조직으로 들어가는 것을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다. dimethyl sulfoxide가 포함된 시약을 취급할 때 이 물질의 위험에 적합한 장비와 관행을 사용해야 합니다. 현지 규정에 따라 시약을 폐기하십시오.
냉동 작동 셀 스톡에서 세포 성장
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계대의 수를 결정합니다. 예를 들어 이전 세포가 동결되었고 세 번 해동된 경우 해동 과정은 네 번째 계대가 됩니다.
세포주, 계대 번호 및 날짜가 표시된 T75 플라스크에 성장 배지(최소 배지, 송아지 혈청 및 항생제)를 추가합니다.
적어도 15분 동안 37도 및 5% CO 인큐베이터에 플라스크를 수평으로 놓습니다. 이것은 매체를 예열하고 정상 pH(7.0-7.6)로 만듭니다.
부드럽게 교반하면서 37도 수조에서 세포주와 함께 냉동 바이알을 해동합니다. 오염 위험을 줄이려면 O-링과 캡을 수위 위로 유지하십시오(2-5분).
바이알을 생물학적 안전 캐비닛(BSL-2)에 넣습니다. 오염을 방지하려면 바이알을 열기 전에 70% 에탄올로 닦아내십시오.
냉동 세포 플라스크 내용물을 성장 배지가 들어 있는 T75 플라스크로 옮깁니다. 플라스크 표면에 세포가 고르게 분포되도록 플라스크를 부드럽게 섞고 흔듭니다.
플라스크를 CO2 인큐베이터에서 밤새 37도에서 5% CO2로 배양합니다. 세포가 밤새 부착되도록 허용
변화하는 성장 매체
37도, 5% CO2에서 추가 2-4일 동안 플라스크를 배양하고 세포가 자랄 때까지 모니터링합니다.
세포가 약 90% 컨플루언스에 도달하면 T150 플라스크를 사용하여 셀 스톡을 확장할 수 있습니다.
